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細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用檢測(cè)法:時(shí)間分辯熒光分析法

更新時(shí)間:2021-07-12點(diǎn)擊次數(shù):1260

時(shí)間分辯熒光分析法

1 )銪熒光檢測(cè)法

標(biāo)記靶細(xì)胞

1. EuCl3 的制備:稱(chēng)取 58.08mg Eu2 O3 ,用少量 1N HCl 攪拌至溶解,再用 1N NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 4.0 。加雙蒸水配成 33 ~ 100mmol/L 的保存液, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?br />2. 用預(yù)冷的標(biāo)記液將靶細(xì)胞濃度調(diào)整到 5 × 106 /ml ,加 50 μ l 10mg/ml 硫酸葡聚糖,置冰浴中 20 分鐘,其間搖晃數(shù)次。
3. 加入 30 μ l 100mmol/L CaCl2 溶液終止反應(yīng) 5 分鐘。
4. 用含 2mmol/L CaCl2 的 RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 5 次。用含 10 %小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將靶細(xì)胞配成 5 × 104 /ml 。


檢測(cè)方法

1. 在 96 孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞懸液,每孔加 100 μ l 。
2. 向各孔加 100 μ l 效應(yīng)細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例根據(jù)要求而定,通常為 5 : 1 ~ 20 : 1 。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加 100 μ l 培養(yǎng)液,最大釋放孔中加 100 μ l 0.5 % Triton X-100 。每個(gè)實(shí)驗(yàn)置三個(gè)復(fù)孔。
3. 置 37 ℃ 5 % CO2 的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 小時(shí)。
4. 從每孔吸出 20 μ l 上清液,對(duì)應(yīng)加入另一塊 96 孔酶標(biāo)板中,向第二塊板每孔加 200 μ l 增強(qiáng)液。室溫中混合 5 分鐘。在時(shí)間分辯熒光分析儀上測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度。同時(shí)做 EuCl3 的標(biāo)準(zhǔn)曲線:用 0.05mol/L pH7.0 檸檬酸緩沖液配制 10 倍梯度
5. 特異性殺傷活性計(jì)算: 殺傷活性(%)= [ (實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度-自然釋放組熒光強(qiáng)度) / (最大釋放組熒光強(qiáng)度-自然釋放組熒光強(qiáng)度) ] × 100 %


2 )用時(shí)間分辯熒光檢測(cè)法同時(shí)檢測(cè) NK 細(xì)胞對(duì)三種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性

標(biāo)記靶細(xì)胞

1. 取 107 靶細(xì)胞,用洗滌液(含 93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl 和 2mmol/L MgCl2 的 50mmol/L pH7.4 Hepes ,雙蒸水配制)洗滌一次。小心吸去上清液,用 1ml 標(biāo)記液(洗滌液中加 0.5mg/ml 磷酸葡聚糖和 0.06mmol/L Eu3+ 或 2mmol/L Sm3+ 或 0.2mol/L Tb3+ ,以及比鑭系離子濃度高 5 倍的 DTPA )懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液置冰上 20 分鐘,每 3 分鐘上下吹打 1 次。
2. 加入 2ml 終止液(洗滌液中加 2mmol/L CaCl2 和 10mmol/L 葡萄糖),終止標(biāo)記反應(yīng)并使細(xì)胞膜上的孔隙封閉。 5 分鐘后用終止液洗滌 3 次,用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌 3 次,每次洗滌時(shí)離心 500 × g 10 分鐘。
3. 用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成 1.2 × 105 /ml 或 5 × 104 /ml 備用。

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